西南医科大学口颌面修复重筑和再生实习室分享：正畸牙搬动模子小
原标题：西南医科大学口颌面修复重建和再生实验室分享：正畸牙移动模型小鼠的实验方法
文题：正畸牙移动模型小鼠压力侧牙周膜细胞自噬与Hippo-Yes相关蛋白通路的关系
SPF级雄性C57BL/6小鼠，6-8周龄，体质量(25±7) g，购于成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK(川)2020-030。此次实验严格按ARRIVE指南执行[18]，符合赫尔辛基宣言的道德标准，已通过西南医科大学伦理委员会审批，审批号：20210819-17。54只小鼠按随机数字表法分为9组，每组6只，空白组小鼠不做任何处理，实验组小鼠行正畸牙移动建模，建模时间分别为30 min，1 h，2 h，4 h，12 h，1 d，3 d，7 d。
结扎丝(杭州西湖)；0.12 mm镍钛螺旋拉簧(上海埃蒙迪)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色试剂盒、EDTA脱钙液、40 g/L多聚甲醛溶液、苏木精-伊红染液、DAB试剂盒(北京索莱宝)；Beclin-1、LC3B抗体，SP免疫组化检测试剂盒(北京博奥森)；active-YAP抗体(Abcam，美国)；YB-7LF冷冻包埋机、YT-7FB型生物组织摊烤片机(湖北亚光)；半自动轮转式切片机(Leica，德国)；显微摄像系统(Olympus，日本)。
1 牙移动建模各实验组小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定已成功麻醉的小鼠，拉开小鼠的口角，用正畸结扎丝扎紧其右上第一磨牙，结扎丝再与镍钛螺旋拉簧连接，用测力计确定30 g近中向拉力，再用结扎丝将拉簧固定于上颌两切牙上，光固化树脂将上切牙和结扎丝一起包围固定，见图1。建模后进软食，每天检查小鼠口内装置是否稳固。
2 牙移动距离测量、取材造模后按设定时间点(30 min，1 h，2 h，4 h，12 h，1 d，3 d，7 d)，注射过量戊巴比妥钠处死小鼠(保证小鼠能死亡，具体剂量为100 mg/kg)。在小鼠未死亡前，用带表游标卡尺(50分度)测量其牙移动距离。测量方法为：先测量小鼠右侧上颌第一、二磨牙的近中边缘嵴最突点之间的距离，再用此距离减去第一磨牙矢状向宽度所得即为牙移动的距离。同一实验者测每只小鼠的牙移动距离3次，取3次测量值的均值为该小鼠的牙移动距离。而后分离小鼠的右侧上颌骨，去净附着软组织，取第一磨牙及其周围骨组织。
3 石蜡切片的制备40 g/L多聚甲醛固定取材所得小鼠右上第一磨牙组织块1 d，固定完成后，于PBS中浸泡1 d；然后组织进行脱钙，使用pH=7.2的EDTA脱钙液；脱钙完成后，组织块常规脱水、透明。将组织块按第一磨牙颊侧或腭侧朝上行包埋，切片时沿小鼠磨牙长轴的矢状向方向切，切片的厚度为4 μm，选取磨牙近、远中根均完整的切片捞片，切片于4 ℃保存备用。
4 苏木精-伊红染色切片先烤30 min，再脱蜡水化，随后用苏木精染7 min，自来水洗2 min；而后用盐酸乙醇分化30 s，自来水泡15 min；再用伊红染40 s，自来水洗2 min；脱水透明；封固，显微镜下观察。
5 TRAP染色烤切片30 min，再脱蜡水化；稍晾干切片，TRAP固定液4 ℃固定1 min，自来水洗2 min；按说明书配制TRAP孵育液，避光37 ℃孵1 h，自来水洗3 min(×2)；再用苏木精染7 min，自来水洗3 min；而后将切片脱水透明，封固。显微镜下计数压力侧破骨细胞。
6 免疫组化染色60 ℃烘烤切片过夜，脱蜡水化；用抗原修复液于37 ℃环境中修复30 min，UP水冲洗，PBS洗5 min；用H2O2(浓度3%)作用20 min ；加山羊血清孵20 min，室温，倾去，勿洗；加一抗：LC3B浓度为1∶200，Beclin-1 浓度为1∶400，active-YAP浓度为1∶2 000，4 ℃ 孵育过夜，PBS洗3 min(×3)；稍晾干切片，加二抗(试剂盒内匹配的二抗为直接使用原液，无需再配制)后盖上同组织大小的封口胶，孵20 min，室温，PBS持续冲洗3 min(×3)；加SA/HRP，孵15 min，PBS洗3 min(×3)；DAB显色，自来水冲洗；苏木精复染。切片脱水透明。封固后镜下观察牙根压力侧牙周膜近冠1/3部分，取不重叠视野3个，采图。图片中目的蛋白的平均吸光度值使用Image Pro-Plus 6.0软件分析。
建模后按设定时间点(建模后30 min，1 h，2 h，4 h，12 h，1 d，3 d，7 d)处死小鼠，观察测量磨牙移动的距离。磨牙组织切片，苏木精-伊红染色观察压力侧牙周膜形态改变；TRAP染色计数压力侧破骨细胞数量；免疫组织化学染色观察细胞核YAP蛋白以及自噬相关蛋白LC3B、Beclin-1在压力侧牙周膜细胞内的表达情况。
